徕卡显微镜动态超分辨率显微镜

超分辨率显微镜技术彻底改变了生物学，因为在过去十年。 在他们的帮助细胞组分现在可以在蛋白质的大小可视化。 然而，成像活细胞是对于大多数的超分辨率的原则是一个挑战。 在这方面，一个名为uPAINT（通用积分累积成像纳米级地形）技术抓住了关注。 此单分子方法利用连续标记，任意生物分子膜的动态成像在活细胞中以非常高的密度以显示超分辨的图像和单个分子的轨迹。

定位显微镜

例如STORM，dSTORM / GSDIM或（SPT）的PALM基于本地化超分辨率技术基于时间去相关的荧光。 通过实现分离的分子“发射，随后将其定位与subdiffraction精度可以用来重建超分辨的图像。 为了使这些方法来工作，视场内的分子的绝大多数必须处于非发光状态。

为了实现荧光发射的时间分离，制定了几种方法：

• STORM（随机光学重建显微镜）方法，通过将大多数人口的进入一个黑暗的状态，具有高功率激光照明的帮助下实现单分子的时间分辨荧光.为了使这种方法的工作样品必须被嵌入在氧化或还原缓冲剂以稳定的荧光团的断开状态。 随机的分子的一个亚群逸出从暗状态和发出荧光。 这种“对速度”可以是微调由围绕标本和照明与第二激光（405纳米）的解决方案，它减少了在关闭状态的寿命。

• PALM（图片激活定位显微镜）技术采用光活化/敞篷荧光蛋白，可以“变身”开和关。激活后，他们进行成像，直到他们漂白。 在这种情况下，激活光源的强度决定了荧光激活率。

用定位显微镜技术的帮助下，一个子衍射分辨率达到和细胞组分可在前所未有的细节进行可视化。 然而存在用于这些类型的方法实现，即天然蛋白质的超分辨图像上活细胞的一个重大挑战。

当研究人员要求，研究内源性蛋白在高密度在活细胞中，无论是STORM 也PALM技术完美地完成所有必需的前提条件。在基于STORM的情况下，接近降低成像缓冲区与活细胞不兼容。 PALM又取决于遗传修饰的嵌合光活化的荧光蛋白质的利用率，从而内源性蛋白不能被观察到。

通用积累点成像的纳米地形（uPAINT）是一个复杂的技术规避这些问题。它的工作原理是动态成像单分子轨道上下偏斜照明细胞表面，因此导致在超分辨的天然生物分子的行为的跟踪，在活细胞的表面上。

相比之下，传统的定位显微镜方法，其利用用于成像的分子的一小部分随机的荧光发射，uPAINT由成像低浓度的荧光配体，因为它们结合，并与它们的靶相互作用的小光量内实现荧光信号的时间分离。

该uPAINT原则

通用PAINT追溯到原来的做法称为漆 （点积累的成像纳米拓朴图）。用于此目的的荧光标记的探针扩散在溶液中，并开始在结合到感兴趣的对象，以发出荧光。阿列克谢Sharanov和Robin Hochstrasser通过连续靶向脂质双层和大单层囊泡与尼罗红是不发荧光的水溶液而开始发荧光在疏水环境中引入这种方法。在水中快速分子扩散导致尼罗红的恒定通量在膜的附近。随后出现从它进入膜的时刻的荧光信号。在这种新的环境探测成为荧光和流动性急剧下降，使得其检测带摄像头（几毫秒），直到光漂白发生。 通过确定每个单独的荧光信号，大约分辨率的心25（nm）是可能的。 然而，由于非常短的持续时间插入（毫秒）就不可能追踪单个分子在长时间内的行为。（奥林巴斯显微镜）

后来格雷戈里Giannone和Eric Hosy重点，克服一些原漆技术的局限性。 通过使用特定的荧光配体（即抗体）代替非特异性膜染料，单，特定蛋白质相互作用的动态成像成为可能。由于更广泛的应用带宽，这种方法被命名为通用PAINT。

对于这种技术背景未结合标记的配体存在于培养基中的荧光，通过使用斜光 （图1）克服。从转移其预期使用TIRF激光是关键。发送激光略低于临界角向载玻片导致了“ 高度倾斜和层压光学片 ”（HILO）倾斜穿过试样的形成。 本卷中只有荧光很兴奋。

低浓度的标记的配体加入到介质洗澡的检体内部的缓冲器。布朗扩散导致配体在细胞表面的连续和随机结合到它们的目标。希洛光路内只荧光很兴奋和成像（图1）。

A）                                        B）

图。1：uPAINT原则。 A）徕卡SR GSD 3D提供了机会，调整激光束的渗透角度。 与它的TIRF（全内反射荧光）照明可以实现，如果该激光打玻璃滑动标本相间超越所谓临界角θ

与此相反，以用于涂料脂质探针的相对较短和插入依赖性荧光，从用于uPAINT配位体的信号通过光漂白的染料，而不是配体解离速率的主要是限制。

因此，结合的配体的运动可以被跟踪和记录有子衍射分辨率。随后的数据分析和重建的配位体的运动导致所谓的轨迹，表示他们的路线。由于大量的数据可以被收集，关于配位体'的速度，分娩，簇组织等统计信息可以被提取，例如，研究膜受体在突触。

各种生物问题可以探讨与uPAINT。 由此，各荧光探针具有仔细根据不同的用途来进行选择。例如，以到达受限制的地区，小的探针如Tris NTA-ATTO或Fab片段可以用（约2纳米以记录长的轨迹，多耦合抗体是优选的。有趣的是，即使单个分子的FRET实验可以开发

总之uPAINT不仅产生超分辨的图像，但也提供了超分辨上在活细胞中的单，具体的，膜结合的生物分子的动态信息。 而相比之下，传统的定位显微镜技术，uPAINT规避有害缓冲剂或遗传修饰的蛋白的用途，并相应地使邻近的自然条件下，观察

所述uPAINT技术的一个限制是，它被限制为质膜结合的分子的研究。因为荧光标记的抗体，不能穿透活细胞的完整细胞质膜，这是不可能用uPAINT来研究细胞内蛋白质的动态。

uPAINT与徕卡SR GSD 3D

徕卡SR GSD 3D提供了两种基本的操作模式：落射荧光和全内反射荧光照明。 对于TIRF（全内反射荧光）照明的照明器的TIRF准直的激光束到盖玻璃，含有在水溶液中的检体。 如果激光束超过临界角，以该玻璃滑动水相间，发生全反射。在同一时间的渐逝波传播入试样在玻璃载片的另一侧。 其刺入深度可以从80至250纳米通过倾斜角度的激光被操纵。 渐逝场内部仅荧光团将被激发，产生了非常好的信噪比。 出于这个原因的TIRF照明是优选的技术观察近质膜过程（图1）。

通过移动激光入射低于临界角时，它把载玻片，并随后照射试样倾斜。 装置只有样品的一小部分是由激发光照亮。 在此所谓的HILO获取的图像（高倾斜和层叠光学片）模式显示出低背景和良好的信噪比。 此外漂白和光毒性可以降低用这种方法得到的在延长的细胞生存力（图1）。

在实践中的Leica SR GSD 3D提供了两种不同的工作模式下工作的激光束的TIRF分别HILO照明（见图2）。

自动模式可以选择预定义的穿透深度逐步介于80和250纳米。此外，渐逝场（方位角）的方向可以以四种不同的方式来确定。

在专家模式允许自由选择的穿透深度的渐逝场的移动的绿色区域内的滑动件（见图2）。超出绿区的激光超过临界角，并开始以诱导HILO偏斜照明。

A）                       B）                        C）

图2：自动与专家模式：穿透深度和激发激光束的方位可以由成像软件控制。 A）自动模式使从80到250纳米加上四个不同的消逝场方向选择的穿透深度的消逝场逐步的。 B）专家模式可以设置的穿透深度无级采用了滑盖。 绿化面积标志着TIRF区。 C）把滑块出绿色TIRF区达到HILO照明。

对于一个uPAINT实验中，生长在玻璃底室的细胞应覆盖有非荧光介质（离子溶液如台氏培养基）并置于显微镜。在明模式搜索细胞后可以识别并专注于观察一个有趣的领域。随后在显微镜必须被切换到GSD模式，正确的滤波器立方体和激光必须选择。 现在，专家模式有助于找到HILO照明的正确设置（见上文）。 注意该滑块和该激光的渗透角的依次位置取决于单元厚度。 事后荧光团偶联的抗体或配体，必须向培养基中加入。在随后的采集仅荧光团结合到相关抗原在细胞膜会发出荧光。 由于偏斜照明，未结合的配体将不会被激发，从而防止它们的漂白和降低噪音水平。在实验的过程中，质膜蛋白的恒定标签可以被成像。 原始数据文件随后可被用于重建的本地化和单个分子中的超分辨率的动态变化。

uPAINT实验有时需要长采集周期（几十秒）来揭示感兴趣几乎所有蛋白质的运动和组织。在这种情况下，漂移可以通过图像图像检测珠的位置（FE TetraSpeck TM）的修正。 收购完成后，徕卡SR GSD 3D软件能够通过珠的本土化自动重新定位每个图像。研究纳米团簇例如，当这种漂移校正模式是必不可少的。

总括而言，徕卡SR GSD 3D提供不同的照明方案。 它原来的用途是做下TIRF或落射荧光照明dSTORM / GSDIM超分辨率显微镜。此外，HILO照明可以进行的，必需的uPAINT。因而两者，蛋白质静态以及动态数据可以收集与一个显微镜使该组织的超分辨检查外加蛋白质的内源性水平在活细胞的动态。