脑组织浮动冷冻切片间接的单、双和三的免疫荧光

间接（两阶段）免疫是一个功能强大的成像技术，使得能够高度特异性靶使用主（直接）和次级（间接）抗体的组合的可视化。 脑组织中的兴趣抗原决定首先用从公共主机随后定向到主机初级和缀合的合成的二级抗体是单克隆或多克隆第一抗体（小鼠，兔，鸡，鼠，驴等）或自然荧光。 间通常标记为在脑组织切片的抗体目标是胶质纤维酸性蛋白（GFAP），神经元和轴突神经丝（既磷酸化和非磷酸化;重，中，和光），第三类的β微管蛋白，微管相关蛋白，血 - 脑屏障的蛋白，突触蛋白，髓鞘，和主机与特定疾病相关的抗原。

间为在脑组织中的抗原的可视化的有用的荧光染料是罗丹明，荧光素，所述的Alexa Fluor系列，和花青染料。 复染使用各种流行的DNA结合染料的细胞核如下与二级抗体治疗。 该协议细节一个通用方法在厚度染色30和50微米之间的冷冻脑浮冷冻切片。

显示在图1是一个共聚焦图像揭示神经胶质纤维酸性蛋白和神经细丝重的复杂网络结构，鼠脑海马区（冠状面）的厚（30微米）部分。 的部分进行染色如下详述使用鸡抗NF-H和兔抗GFAP的一抗的鸡尾酒，随后山羊抗鸡和抗 - 兔二级抗体缀合到合成荧光团的Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 568，分别。 细胞核进行复用DRAQ5。 使用488纳米的氩离子激光（的Alexa Fluor 488）将试样成像用60倍的油浸物镜（无放大），一个543纳米的氦氖激光（Alexa Fluor 568），和一个633纳米氦氖激光（DRAQ5;伪彩色青色）。 脑切片图像以灰度获得并随后伪彩色与色调近似的各探针的荧光发射光谱，除如上所述。

试剂

• Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（PBSA） -溶解的0.2g氯化钾，0.2克磷酸二氢钾，8.0克氯化钠，1.74克磷酸氢二钠（七水合物）的一升双蒸水。 将pH调节至7.2，用浓氢氧化钠。

• 磷酸盐缓冲盐水与钙和镁（PBS） -溶解的0.2g氯化钾，0.2克磷酸二氢钾，8.0克氯化钠，1.74克磷酸氢二钠（七水合物）的一升双蒸水。 溶解这些试剂后，加入0.132克的氯化钙二水合物和0.10克氯化镁六水合物。 将pH调节至7.2，用浓氢氧化钠。 此外，二价碱土金属的缓冲溶液是有用的，以确保未冷凝染色质保持不变，染色过程中的核内包含的，使用通过紫外线照射（DAPI和Hoechst公司）激发DNA探针时大大降低背景荧光水平。

• 固色剂 -溶解在温和加热百毫升PBSA 3.7克多聚甲醛（准备新鲜的定影液每天）。 冷却后，过滤该溶液。

• 透缓冲器 - 0.2％的Triton X-100的PBS（声处理洗涤剂缓冲器30分钟，以在使用前立即一小时）。

• 阻断缓冲液 -在PBS中的10％正常山羊血清（NGS）含0.05％的曲拉通X-100（加2-3毫克叠氮化钠的每100毫升封闭缓冲液，以消除微生物的生长）。 如果正在使用的第二抗体的宿主比山羊等，制备封闭缓冲液与来自该物种的正常血清。（奥林巴斯显微镜）

• PBS洗涤缓冲液 -使用PBS缓冲液固定后，透化之前和与初级和二级抗体探针之前立即除了那些需要专门缓冲器核染料是不用PBS兼容组织核染色后处理。

• PBS-海卫洗涤液 -对于洗序列立即通透后抗体治疗后（核染料染色前），用PBS含0.05％的的Triton X-100。

• PBS-的Triton洗涤缓冲液与阻断血清 -对于洗涤序列的初级和二级抗体孵育之间和二次抗体处理后，立即用PBS中0.05％的曲拉通X-100和1％的正常宿主（山羊）血清。

• 初级抗体混合物 -加入浓缩的初级抗体原液适当体积，以封闭缓冲液稀释的50％的用PBS-的Triton洗涤缓冲液（从而得到Zui后的浓度为5％的正常山羊血清）。 从不同的主机几个初级抗体可混入鸡尾酒。 组织薄片收到250-500微升抗体溶液。

• 次级抗体/鬼笔环肽鸡尾酒 -添加缀合到所选择的荧光第二抗体的适当体积（例如，8微升的山羊抗小鼠重链和轻链的次级IgG抗体的Alexa Fluor 350在2毫克每毫升）和20-30微升鬼笔环肽原液（6.6微摩尔）至1毫升封闭缓冲液稀释50％的用PBS-的Triton洗涤缓冲液的（从而得到Zui后的浓度为5％的正常山羊或其他宿主血清）。 在许多情况下，phallotoxin肌动蛋白探针可以被与来自其它物种（匹配于初级抗体）的一个或多个附加的第二抗体。 作为与第一抗体混合物，组织薄切片接收250-500微升的二级抗体溶液。

• 核染料 -染色准备核染料新鲜稀释之前立即。 当使用SYTOX，DRAQ5和花青核污渍，背景荧光可显著（特别是在细胞质中）加入10毫克RNA酶的封闭缓冲液减少。 在这种情况下，块的细胞或组织，在37摄氏度左右，而不是在室温下，以活化该酶。

• 核染料洗涤缓冲液 -赫斯特和SYTOX染料需要Hanks平衡盐溶液（ 汉克斯BSS），而DAPI，以及单体和二聚体花青核污渍，可以用PBS使用。

核染液稀释

• 赫斯特（33342和33258） -稀释5微升的10毫克/毫升储液在150毫升汉克斯BSS的（治疗30分钟）。

• SYTOX绿和橙色 -稀释10微升的在250毫升汉克斯BSS的（治疗，30分钟）浓缩的储备溶液（5毫摩尔的二甲亚砜）。

• DAPI -稀释5微升的10毫克/毫升储液在150毫升PBS中稀释50％的用双蒸水（处理5分钟）。

• 单体和二聚体菁染料 -稀释浓缩的储备溶液（例如，TO-PRO-3;通常为1毫摩尔），为制造商推荐的（1:20至1：100）的PBS（处理5〜30分钟）。

• DRAQ5 -稀释浓缩的储备溶液（通常为1毫摩尔），为制造商推荐的（1:20至1：100）的PBS（处理5〜30分钟）。

步骤

传输的一个或多个冷冻（摄氏-80度）的浮动冰冻切片到6孔培养皿中，在冷冻室的温度并置于干冰上运输。轻轻加入2毫升的PBS缓冲液中，以每孔含有一个部分，以允许部分解冻并漂浮在缓冲器中。 缓慢将培养皿至室温，旋转组织切片，因为他们正在水合定轨振荡器上以每分钟5-10转。

注意：不要让部分，以加入PBS缓冲之前温至室温。 小心吸说明远离浮动部分用巴氏吸管和挤压球（不使用真空吸气器）的所有解决方案。

浮动切片固定除去从该动物前，但也可以再次补液后使用多聚甲醛处理30分钟的固定。 这是一个可选步骤。

15分钟（每次洗涤）洗涤每个部分4次在PBS中。 缓慢旋转的组织切片，因为他们正在以每分钟5-10转洗涤在定轨振荡器。

溶解在组织切片用透化缓冲液的膜进行处理两小时。 缓慢旋转的组织切片，因为他们正在透定轨振荡器上以每分钟5-10转。

阻断非特异性的二级抗体和合成的荧光团结合位点的封闭缓冲液在37摄氏度2-4小时。

封闭后，小心添加第一抗体鸡尾酒（每个培养腔室孔1毫升）不干扰的组织切片。 孵育覆盖培养板中，在冰箱中（4摄氏度）进行48小时的聚乙烯袋中。 这是没有必要覆盖培养室用铝箔（避光）在这一点上，因为荧光团不存在。

在加入第一抗体后的第二天，用PBS-的Triton洗涤缓冲液含1％的阻断血清洗浮动部分的四倍（20分钟每次洗涤）。 缓慢旋转的组织切片，因为他们正在以每分钟5-10转洗涤在定轨振荡器。

清洗顺序后，小心添加辅助抗体混合物（每文化室以及1毫升）不干扰组织切片。 孵育覆盖培养板中，在冰箱中（4摄氏度）进行48小时的聚乙烯袋中。 通过将铝箔的片材在培养室避光。

上与第二抗体处理后的第二天，用PBS-的Triton洗涤缓冲液含1％的阻断血清洗浮动部分的四倍（20分钟每次洗涤）。 覆盖培养室用铝箔（以保护光），缓慢旋转的组织切片，因为他们正在以每分钟5-10转洗涤在定轨振荡器。

通过洗涤该组织切片用PBS为两个或三个缓冲液交换（每次15分钟洗涤）完全除去阻断血清的洗涤缓冲液。

对于DAPI和花青核counterstains，在PBS中以及添加的稀释染料到培养腔室和处理的样品中推荐的时间：5-10分钟DAPI; 15-30分钟花青染料（从光用铝箔保护）。 当使用的Hoechst或SYTOX污渍（孵育30分钟）时，首先要复染洗在Hanks平衡盐溶液的载玻片两个缓冲交换之前。

用PBS或Hanks平衡盐溶液（取决于核染料）三次在15分钟时，每次洗涤洗counterstained标本。 保护从光用铝箔。

Zui后洗涤步骤后，将一个22×22毫米（或22×50毫米，这取决于截面尺寸）盖玻片下的每个部分，并仔细吸出缓冲用吸管，同时定位部分下的玻璃，使其附着中心的盖玻片。 经过缓冲已被完全删除，拉盖玻片从井钳的帮助。 放置盖玻片放在一个平面上，加一滴安装介质，放在部分清洁的显微镜载玻片和转动滑动用盖玻片上下倒置。 离开载玻片在室温下至少1-2小时以干燥该部分。