徕卡显微镜冷冻电镜在纤毛和鞭毛新的见解

纤毛和鞭毛是第一细胞器被发现并且已经研究了几个世纪。 但是，在人类中的重要作用，以及如何睫状缺陷引起的疾病仍然没有得到很好的理解。 冷冻电镜Zui近流下了新光源对他们的内部运作，并解决了一些长期存在的谜团，只有提高对纤毛和鞭毛的功能是如何的新问题。

介绍冷冻电镜

低温电子显微镜（冷冻电镜）允许用于观察生物样品尽可能接近天然状态尽可能的高分辨率结构。与传统的电磁法没有化学固定剂，如戊二醛或osmiumtetroxide，或对比增强重金属的污渍，如乙酸双氧铀，被使用。这Zui大限度地减少了固定和染色文物的风险。相反，将样品快速冷冻并直接在电子显微镜可视化而被不断地冷却，在温度低于-160℃。 用于小样本-蛋白质复合物，脂质体（参见图1），病毒，原核细胞，细胞器-浸没冷冻（“切入冻结”）是选择的样品制备方法。使用格柱塞诸如徕卡EM GP，薄膜样本是通常为20至500纳米厚是制备并快速冷冻在冷却冷冻剂如乙烷在温度刚好高于冷冻剂的熔点，以便实现样品的玻璃化。 较大的样品（Zui常见的是，真核细胞和组织）太厚为切入冷冻，并且可以使用高压冷冻随后冷冻切片制备。

图1：冷冻电镜显微照片，显示所引起的膜蛋白（NEC220）的突变中的脂质体（的LUV）的形态变化。 比例尺：500纳米（A）; 100纳米（B＆C）。 从Bigalke等人，2014年修改。

新的见解和纤毛鞭毛由冷冻电镜

已特别是从冷冻电镜的分辨率增加受益的一个研究领域的一个例子是纤毛和鞭毛的研究。 纤毛和鞭毛是高度保守的，普遍的运动和在真核生物执行许多重要任务传感细胞器。在人类睫状缺陷引起多种病症和疾病，统称为ciliopathies。链接结构的功能是必不可少的理解纤毛是如何工作的，以及为什么它们在疾病失败。 样品制备通过冷冻水垫随后结冰由低温电子断层扫描（低温ET） - 一个三维（3D）冷冻电镜技术 - 随后的图像处理（subtomogram平均）已被证明是非常成功的策略，以获得前所未有的见解3D结构和纤毛和鞭毛的功能（图2和3）。 冷冻ET引入只在2006年纤毛研究不仅提供了更高的分辨率，接近原生状态，3D结构，也极大地改变了我们如何纤毛的功能，什么不顺心的疾病的认识。相比于仅仅在几年前，我们现在知道，微管是不是空心的，空管，但含有微管内的蛋白质（MIPS）; 在连接蛋白的链接被发现数十年前，现已被确定为动力蛋白的一部分管制络合物; 径向辐条具有小的结构和可能的功能差异，我们有我们的第一一瞥数万动力蛋白马达分子如何协调以生成纤毛运动。随着这些突破了许多新的问题已经被提出，并仍在等待答复。（奥林巴斯显微镜）

图2：冷冻-ET衍生断层片和平均96毫微米重复等值面效果 - 真核纤毛和鞭毛的构建块。 比例尺：100纳米。 从Heuser先生等人，2012。

图3：低温-ET从衣藻 （绿藻）和海胆 （海胆）平均后得到的鞭毛平均中央机构的结构等值面效果图。 从卡瓦哈尔冈萨雷斯等人，2013修改。

挑战与改进/相关显微镜

冷冻电镜的增加的分辨率和质量是有代价的：已知的问题，包括辐射敏感性（由于不存在化学固定剂）和低对比度，噪声图像（低信噪比由于缺乏重金属对比的试剂）。 这些挑战通常可以通过操作该显微镜在低剂量模式，以尽量减少样品暴露于辐射和使用图像处理（平均化），以从多个图像中的信息相结合，以增加信噪比，并Zui终分辨率来克服。 相制版技术，尤其是直接电子探测器的Zui新进展已推向接近原子范围内实现分辨率

然而，虽然冷冻电镜提供感兴趣区域的高分辨率快照它既不适合扫描的更大的区域，也没有对实时成像。这些不足可以通过如相关光学和电子显微镜（CLEM）相关显微镜技术来克服。 CLEM结合了两全其美。 光/荧光显微镜用于易活细胞成像，观察标记（如绿色荧光蛋白，绿色荧光蛋白），以确定合适的时间和感兴趣的领域。然后这个区域进一步用电子显微镜的分辨率高功率（图4）检测。 一个令人兴奋的新的有前途的CLEM发展是徕卡冷冻阶段，其允许观察冷冻样本由光/荧光显微镜在温度低于-160℃。 这不仅大大地减少荧光漂白，但也允许感兴趣的冷冻样品中的区域（通常荧光标记的目标）的光/荧光显微镜鉴定第一。 然后将样品（同时仍然被冷却在低于-160℃）可以很容易地转移到电子显微镜，以通过冷冻电镜重温的高分辨率研究感兴趣的区域。

图4：高压CLEM冷冻并冷冻取代的HeLa细胞（使用徕卡EM HPM100和Leica EM AFS2）：感兴趣的细胞是由荧光标记物识别和DIC（A，B，D）的荧光显微镜（C）的可视化和EM在低（C），介质（F）和高分辨率（G，H）。 从修改的

迄今为止，每一个分辨率增加EM去手牵手与有关的结构和功能的重要的新的生物发现。 并没有迹象表明，这一趋势将很快结束。