原核表达中目的蛋白不明确不知是不是想要的目的条带

2016-11-28技术资料

原核表达中目的蛋白不明确

原核表达中目的蛋白不明确不知是不是想要的目的条带

初做蛋白表达,目的片段确定插入载体测序正确,用的BL21为宿主菌,尝试了各种条件,比如IPTG浓度有0.1mM、0.5mM、1mM,温度有37,30,25,蛋白电泳结果分析均无明显目的条带,虽在Marker相近位置处有条带表达,但未诱导前也有该条带的表达,且诱导后条带浓度的增加量并不是十分明显,所以很纠结到底是不是想要的目的条带。
请问各位大虾,碰到这种情况,要怎么办?我的蛋白带了His标签,如果我做镍柱纯化的话可否验证条带的正确性,我怕如果那条条带就算是目的条带的话,表达量太少我一纯化损失太多也看不到,求助我该如何处理?

首先必须确认外源基因已经连接到载体且读码框正确,在此基础上如果没有表达,转其他宿主试试。


已确认外源基因转入载体且测序正确,现在不确定的是外源基因有没有表达,因为条带不明显,像是又不像是目的条带,所以想通过纯化看一下,就是怕本来表达量少再一纯化就没了,也鉴别不了到底是不是要表达的条带了。

是不是插入的位点不行,有可能插入的位点不合适造成读码框变化

推荐一个方法,你用低浓度咪唑破碎,然后取1毫升上清,加入50微升镍柱胶(挂好镍了的),混合几分钟,然后离心,去上清,留下的胶直接跑电泳,这样微量的表达也能检测出来。

这个方法非常的棒!!

打算按这种方法试一下,还想请教一下低浓度咪唑破碎液具体成分是什么?做蛋白表达没多久,每次都是直接用PBS洗了再加PBS溶解拿去破碎。还有留下的胶是直接用上样缓冲液混匀跑电泳吧?
再次感谢大虾相助!

western blot检测一下就行了……