尼康显微镜FRET荧光蛋白

荧光蛋白越来越多地被作为非侵入性探针在活的，由于他们有能力进行基因融合​​到有关蛋白质的本地化，运输和动力学研究细胞应用。 此外，荧光蛋白的光谱特性是理想的测量使用福斯特的技术（或荧光）共振能量转移（FRET）显微镜细胞内分子相互作用的可能性。 因为能量转移被限制为小于10纳米的距离，FRET的检测提供了关于融合蛋白的亚分辨率尺度的空间关系的有价值的信息。 这种互动式教学探讨荧光蛋白作为潜在的荧光共振能量转移伙伴的各种组合，并提供有关关键的共振能量转移参数，以及用于显微镜的光学过滤器的建议和光源配置信息。

教程初始化在广角模式与当前流行的FRET对的吸收和荧光发射光谱，增强型青色和黄色荧光蛋白（ECFP，标记的供体 ;和EYFP，标记的受体 ）中出现的光谱信息窗口叠加在发射光谱的汞弧放电灯（蓝色线谱）。 供体发射光谱和受体的吸收光谱之间的光谱重叠区域被示为具有垂直线，并显示在窗口下方的黄色框中的百分比。 同样，吸收光谱重叠（ABOL）和发射光谱重叠（ 易美 ）区域中的红色和蓝色，分别示出，并且也显示为百分比。 福斯特距离 （如下文所述计算），提出以纳米为每个FRET对和上面的应用预置按钮显示。 在本教程中，各种捐助的蛋白质可以选择出现在通道1和受体蛋白的出现在通道2的吸收和发射Zui大值列出每个通道和红外光谱分析法或整个通道可以打开或关闭使用复选框。

为了操作的教程，选择的成像模式（ 广角或共焦 ），然后使用选择的光源下拉菜单中选择合适的照明光源（弧光灯或激光），然后叠加在供体和受体谱。 接下来，点击应用预置按钮，激活提示的激发和发射带通滤波器，以及在二色镜所选FRET对（ 注：这些值仅作为一个起点确定一个有用的过滤器组合 ）。 该滤波器的通带区域可以通过平移滑块或点击箭头按钮对在滑块的两端进行调整。 左侧的箭头按钮对移动整个通带，而右侧的箭头按钮对调节宽度。 过滤器可以暂时从窗口中取消相应的复选框（ES）中删除。 该二色镜滑块可用于调整该光学元件的截止波长。 吸收光谱 ， 发射光谱 ， 激发光源 ，和/或二色镜可打开和关闭与该教程的右侧的复选框。 通过捐助方和切换受体使用选择供体 ，并选择一个接受器下拉菜单时，使用维护状态复选框冻结所有设置。 荧光蛋白的光谱类（蓝色，青色，绿色，黄色和橙色/红色）在这些菜单列出可以使用单选按钮在本教程的上右上角选择。

在本教程中所示的光谱曲线进行了要么聚集了来自文献或在使用纯化荧光蛋白控制的条件下认真记录。 它们被归为比较和显示的目的。 在实际的FRET调查，光谱曲线可能会有所不同，由于在消光系数，量子产率，探针的浓度，并为各种细胞器和活细胞的细胞质内的局部环境中的Zui大峰值的值的波动。 因此，在本教程中所提供的信息应被视为被设计仅用于教学目的。 此外，通过本教程的计算福斯特距离也是基于荧光蛋白的出版光谱参数（消光系数，量子产率，波长分布），并与其他文献值普遍同意。 然而，根据使用来计算的FRET效率的变量，这些值可能不同于在一个实验设定观察。

一本教程的目标目的是为了让游客，探索Zui佳的照明光源和滤光片组合的具体FRET对。 例如，研究新的青色荧光蛋白，如绿，艾希青色（MiCy）时，该教程是检验其在紫色线和蓝色紫色光谱区（405到473纳米），以确定Zui大激发效率激光器有用此探测器。 同样，各个电弧放电灯（水银，氙和金属卤化物）的光谱可以被叠加在供体的吸收光谱相匹配的激发滤波器带宽和波长分布，可能是容易在实验室。 本教程也是有效的确定大致的激发和发射光谱扩散到水平的新探头的组合，而如果过多，可能会在定量分析出现问题。

当荧光蛋白进入激发状态，由于通过激光或强烈的弧光灯的等离子体源照明，在分子表现为一个振荡偶极子，并创建特征电场。 在情况下，一个合适的受体荧光蛋白（或其它荧光团）的接近由兴奋蛋白（供体）中产生的电场的边界内放置它，能量可以直接被诱导跃迁电动相互作用传送来自供体在受体。 中间的光子不参与。 能量转移的效率是依赖于供体的电场幅度的平方，并且这个字段衰变作为供体和受体之间的距离的倒数第六功率。 福斯特距离表示分子分离在其中能量传输是50％的有效率。 对于发生可测量的烦恼，几个要求必须得到满足。 其中一个是对供体和受体荧光基团，它仅限于几个纳米之间的物理距离很强的依赖性。 此外，必须有与受体的吸收光谱的供体发射光谱的显著光谱重叠。 Zui后，无论是供体和受体分子必须在一个有利的相互取向。

在共振能量转移的实际应用，实验生物学的一个关键步骤是在福斯特距离（RO）的价值为目标施主-受主对的计算。在此计算中的Zui重要因素是重叠积分（j（λ）），供体的量子产率在无受体（Q（d）段），和两分子之间的取向因子（κ;这个变量的平方）。 在本教程中，重叠积分是根据公式计算：

其中，消光系数（ε（λ））被表示为每厘米，波长以纳米，并且给体作为波长的函数的归一化荧光强度倒数摩尔的单位是无量纲的。 重叠积分计算取决于许多变量，包括在荧光发射光谱曲线和供体的量子产率的环境影响。 对于具有高量子产率和受体具有大消光系数供体，该光谱重叠积分会​​更大，导致更有效的FRET伙伴具有较高滚装值。 虽然折射率不发生变化，以典型的水性溶剂或蛋白质之间有很大程度，在福斯特距离计算该参数显示为第四功率的倒数，甚至相对微小的变化可以呈现更大的效果比量子产率或重叠积分。 此外，供体和受体之间的偶极 - 偶极相互作用的效率取决于两个偶极子的取向。 取向因子，它描述了这样的接近，范围从0（两个偶极子垂直）到4（偶极子平行）。 在一般情况下，该偶极子被认为是快速移动的时间尺度类似于供体激发态寿命，因而取向被描述为随机的，具有0.67的取向因子（在本教程适用）。 请注意，取向因子近似可导致不确定性分离的基础上的FRET结果在实际的实验中两个荧光基团的距离的估计。