不同类型显微镜所需要的照明亮度分析（荧光，卤素，LED）

无论利用光学显微镜的成像模式下，图像的亮度管的目标，这是一个函数的数值孔径的聚光能力。，正如显微镜的光源照明的亮度是由冷凝器工作数值孔径的平方，试样图像的亮度是物镜的数值孔径的平方成正比。

显微镜的照明系统的情况不同，但是，客观的放大倍率也起着重要的作用，确定图像的亮度。事实上，图像的亮度的横向放大率的平方成反比：
图像亮度α（NA /男）2
其中，NA是物镜的数值孔径，M是放大倍率。上述公式中的给定的比例，表示物镜的聚光能力，在透（注：落射照明的情况下有所不同，如下文所述）。作为选定的目标，具有不同程度的光学矫正的聚光能力，表1中列出。在一般情况下，具有高数值孔径的目标也能更好地纠正像差。因此，对于相同的放大倍率，高数值孔径物镜收集更多的光线，产生一个更加光好的校正图像（见表1），和整体形象，更好地解决。
这是显而易见的，从一个客观的情况下，用于透，图像亮度迅速下降的放大倍数增加了一系列的目标，具有相同的校正，检查表1中的数据。与此相反，利用类似的一连串的落射照明的目标产生越来越亮的图像放大倍率增加，通过在较低的范围内（10倍至40倍），但降低的倾向在更高的放大倍率。也很明显的是一个目标，产生更明亮的图像，在落射照明（相对于透）在Zui高的数值孔径值的趋势。
F（反式）和F（外延）在表1中使用的术语是指一个客观的聚光能力，并根据下面的公式进行计算：
F （反式） = 10 4 NA 2 / M 2
F （EPI） = 10 4（NA 2 / M）2
从理论上讲，照明的强度取决于冷凝器demagnification图像（实际上，在视场光阑的图像变得明亮，因为它是由更小，根据平方律）的光源数值孔径的平方的平方。其结果是，试样图像的亮度是物镜的数值孔径的平方成正比，当它到达目镜（或相机系统），也成反比的物镜放大倍率。因此，当检查标本在透射光中，改变而不改变冷凝器的目标响应数值孔径和放大倍数的变化会影响图像的亮度。
聚光能力选择目标

表1
在落射照明的情况下，同样的考虑也适用，但目标也作为冷凝器的作用，而这必须考虑到当考虑图像的亮度。作为物镜放大倍数的增大，光源像由具有同等作用的量减少（demagnified），导致的亮度水平，是不依赖于物镜放大倍率，更依赖于数值孔径（亮度是由数值孔径的四次方落射照明）。在实践中，图像的亮度变化（见表1）由于客观后孔径大小差异。
当光线水平的限制，Zui高的数值孔径的目标应该被雇用，但应保持在Zui低水平所需的分辨率兼容的目标和目镜的放大倍率。在许多情况下，制造商正在提供更高的数值孔径，和相应的更高的图像的亮度值比类似的放大倍率的的高干燥配对的油浸目标。例如，40x的计划复消色差于表1中浸泡的目的有计划的消色差透镜40倍的干目标的数值孔径的两倍，而在透射光中产生四倍的图像的亮度。这些目标的落射荧光照明下产生图像的亮度的16倍的差异，与生产Zui亮的图像的高数值孔径的油浸版本。图2给出了比较，在低和高数值孔径物镜的光锥之间的尺寸的相对差异。需要注意的是更高的数值孔径的目标有一个更大的光锥，更大的内部透镜元件，能够聚集更多的光从检体比具有较低的数值孔径的目标。

通过显微镜的光学元件发射的光量，作为入射强度的函数，在荧光显微镜中是特别重要的。在情况下，高分辨率荧光成像要求高倍率图像的亮度，Zui高的数值孔径物镜，应采用具有Zui大程度的透光损失降到Zui低。如上所述，图像的整体亮度随着放大倍数的增加迅速减小，因此，应慎重选择，在荧光显微镜的组成部分，通过光学火车通过的光的量Zui大化。
正如上面所讨论，利用荧光显微镜落射照明配备冷凝器和目标的双重目的的目标服务。首先通过光通过激发光滤光片和反射的二色镜的表面在过滤器中的多维数据集的目的，形成一个倒锥形的照明要激发试样。然后，由连接到试样的荧光基团发出的荧光二次聚集通过相同的物镜系统，通过二色镜和屏障过滤器之前，被投射到目镜或成像系统传递回来。作为冷凝器的高数值孔径的目标将增加的信号（光）的强度的方式，与数值孔径的平方成正比。由于集光能力的客观的数值孔径的平方成正比，图像的亮度会有所不同，第四电源的物镜的数值孔径，根据公式：
图像亮度（荧光）αNA 4 / M 2
需要注意的是，在荧光显微镜中，亮度的物镜放大倍率的平方成反比。因此，对于目标相同的放大倍率，照明场和荧光图像的图像的亮度急剧增加物镜的数值孔径，这是主要的原因，制造商生产具有非常高的数值孔径为荧光显微镜设计的目标。
进一步观察试样的目镜放大衍射极限的图像投影到中间像平面的显微镜，也可减少整体观察到的强度的试样。事实上，图像的亮度是目镜的放大倍数的平方成反比，因此需要使用具有尽可能低的放大倍数要方便地观察标本的荧光的目镜。因此，可以在荧光显微镜中，通过使用可用的Zui高数值孔径耦合到Zui低的功率目镜（10倍目镜虽然Zui常用的）目标，以Zui大限度地提高图像的亮度。这些言论主要适用于大型标本地区，有照明的均匀度。在重点突出的点源的光（例如，分钟的荧光球）的情况下，应该是粒子图像的衍射限制的，是独立于放大倍数的尺寸。
增加样本信号
在荧光显微镜中，图像的亮度是由照明的量子产率的荧光团，显微镜的聚光能力的强度。光照强度越大，具有较高的量子产率，荧光信号就越大，图像越亮，直到所有的荧光基团是饱和的。同样，在偏振光图像的亮度受光照强度和试样的双折射相位差。在为四分之一波长的相位差的值，较大的相位差产生更大的双折射，从而更强的信号。

在这两种情况下，图像的亮度控制从检体的信号，这是照明和介绍了试样的光的变化的强度的商品。发光，试样本身发光的情况下，图像的亮度明显受试样发出的光的幅度，或信号，。
这个概念示于图3和4分别为荧光和偏振光标本的，。在图3显示的是反射照明条件下拍摄的立体显微镜配备荧光照明器上的夹竹桃叶薄截面的一对数字图像。当薄部分被激发与赋予绿色荧光蛋白（GFP）的过滤器设置在450和490纳米之间具有一个带通范围，试样表现出微弱的绿色自发荧光（图图3（a）），是高度可见的某些部分的标本，但在别人非常薄弱。与此相反，较长波长的带通滤波器组（530-560纳米，图3（b））中的试样激发产生一个更强大的信号在整个薄膜部的一个明亮的红色的自体荧光。
矿物薄切片用偏光显微镜观察到了类似的情况，如在图4中示出。试样是抛光的30微米的部分几乎完全由钾长石斜长岩，火成岩。当高取向的双折射薄膜部的位置与光轴垂直的偏振器，通过分析仪的光（信号）（图4（a））被Zui小化。然而，当光轴的方向在45度角到分析仪的偏振器（图4（b））相对于由目镜或图像传感器接收的光量达到Zui大。

在其他模式下，如相衬显微镜，微分干涉对比（DIC），暗场，霍夫曼调制对比度等，照明的强度和图像的对比度可以独立变化。然而，从图像信号，即，图像的亮度的增加每单元的光学参数的变化（例如，路径长度的差异），仍然可以由照度的商品和对比度制成每单元在光学参数的变化。为了检测任何光学参数的微小变化，显微镜应Zui大限度地从该特定参数的变化所产生的信号。
通过显微镜的光传输
对于一个给定的冷凝器和客观的数值孔径，倍率，照明装置的亮度，图像的亮度所产生的显微镜仍然可以取决于通过的光学元件上的光传输。光传输依赖于几个因素，包括透镜元件的吸收和水泥，上面的光接口的反射损失，灯套，漫射屏幕，过滤器，偏振器，以及其他辅助光学元件的透射率。在图1中示出典型的传输特性曲线，一组选定的高数值孔径物镜。这些值都或多或少地代表从一个特定的制造商的任何类别的目标，但即使在这些曲线测定的特定类型，确切的传输值可以不同而有所变化，这取决于，例如，防反射涂层和一批玻璃中使用的单个透镜。
一些光学元件的透射率（传输的强度为入射光强度的百分比）可以是波长相关的，即使在可见光范围内，如在图1中示出。另外，在可见光范围内的波长以外，透镜，棱镜，幻灯片，和试样的安装介质的透射率，可以明显地下降。这一事实的实例，20x的计划氟目标传输曲线示于图1，其示出了作为增加400至700纳米之间的波长的透射率稳步下降。该系列中的其他目标不表现出显着程度的​​波长依赖性。
超过200的光学玻璃配方目前已开发并纳入显微镜镜头，反光镜，过滤器和分束器的光学设计师。这些玻璃的性能，如折射率，色散，传输，污染物，潜在的自体荧光，化学和热电阻，和总体的均匀性，通常仔细选择，以确保Zui大的光学性能。然而，这些因素通常会危及在近紫外域或高消光系数，在偏光显微镜下的其他要求，如高传输。一些新的材料，如玻璃fluorocrown，接近天然萤石的属性，同时避免它的缺点，如存在有机污染物和结晶的显微组织，这会严重降低性能的荧光和偏光显微镜。综复消色差的校正，但是，仍然需要在近紫外范围内，减少了传输的两个天然萤石和眼镜。一个理想的妥协往往是半复消色差透镜或萤石目标的，这是一个真正的多用途目标，结合出色的校正，具有良好的对比度，高数值孔径值和高光谱吞吐量。
即使平均只有约10微米或更小的光学厚度的水泥，水泥双峰或多个透镜元件之间下可以具有光谱吸收属性，可能会导致一个不适合特定的应用程序的目标。在大多数情况下，化学和光学玻璃的光学性质的影响，以及一些光学水泥，通常是专有的。

所有在玻璃-空气界面的表面反映了一些光导致的传输损耗时，即使是没有发生光吸收的光束入射界面法线。的发病率增加的角度，反射和透射损失增加的方式是取决于光波的振动方向的方向（垂直于或平行于入射平面的）。每个未包衣的空气-玻璃界面可以反映4％和5％之间的光束垂直入射到表面（参见图5）。透过率每通过未经处理的接口，因此在正常的发病率是95％到96％。通过施加防反射涂层（通常用适当的折射率的四分之一波厚干涉膜），在玻璃表面的光反射可减少到1％或以下的波长和入射角范围适中，如在图5中示出在400和850纳米之间的波长范围内。
多层抗反射涂料已经发展，这样可以减少空气 - 玻璃界面处的反射更广泛的波长范围为0.1％，比低的值。大部分通常使用的多层干涉膜有一个稍微偏绿色调，而不是单层涂料的紫色色调，使他们更容易识别。一些抗反射涂层，尤其是多层的，表现非正常事件波各向异性和偏振相关的光学系统可以大大降低消光系数。
作为客观的复杂性增加，需要更多的镜头元素，突出需要消除内部反射，产生更高的传输，更好的对比度和耀斑少。这些属性是特别重要的事件或反射光的应用程序。单层抗反射涂层，可以追溯到20世纪40年代以来被细化，并辅以多层涂层，增加96％左右（不涂）在可见光谱范围内通过空气 - 玻璃界面传输到近99.9％（采用多层涂层，和上面所描述图4和图5）中示出。图6示出了具有折射率为1.5和1.8（上部和下部的附图，分别）在玻璃表面的多重反射的影响。在较低的折射率（1.5），8个元素与16的表面，每个反射约4％的入射光，在通过只有52％的结果。与此相反，高折射率的玻璃元件（1.8），16未涂覆的表面将只有26％的入射光通过。的单层抗反射涂层增加传输％至85％，而在多层涂层增加此值至约94.6％。吞吐量的增加而相应减少内部散射和噪声，大大提高了图像的对比度，因为它使明亮的特点，明亮，黑暗的暗的功能。

的涂层材料是氟化镁或多种专有的材料，所有这些都具有自己的光学性能，有可能影响给定的光谱区域中的光学系统的传输。在一般情况下，防反射涂层的干扰特性的频谱有限的，建设性的干扰，在可见光范围内的高传输装置在传输频带以外的频率谐波相关的相消干涉。
现代的高数值孔径物镜具有高的光学象差的校正程度包含多达15个单独的透镜元件和多达10-12空气 - 玻璃界面的大部分。如果镜片是无涂层，单独的轴向光线的反射损耗将下降至约50％的透射率，这些目标。与所有使用单层或多层干涉膜涂覆的表面时，透射率可以提高到大约86％到90％。
除了 ​​那些目标中的透镜元件，也有可能存在两个和四个打在现代显微镜的光学列车的玻璃-空气界面之间
灯箱和集电极 - 4-6各透镜元件
内部眼镜直通车 - 2-8反射镜，棱镜及中继透镜
过滤器 - 2-8单元在传输或落射荧光
- 1-4个分光镜观察管和摄像系统
冷凝器 - 4-8透镜，这取决于光学矫正
标本 - 0-4包括幻灯片和盖玻片
目镜 - 4-6视光学校正和设计
相机系统 - 2-6透镜，反射镜和滤芯
在极端的情况下，可以有多达五个客观上的十几个光接口。60无涂层接口将低于9％的轴向射线透过显微镜，一点点超过50％，与所有的表面涂层。
高品质的透镜不仅对提高传输的光通过显微镜进行观察，而且还用于减小由于在玻璃表面的多重反射的喇叭形涂层是必不可少的。然而，即使是Zui好的涂层将不会超出一定的波长范围内工作。对于某些波长，甚至可以增加涂层的反射率（一个半波的干涉膜是一种完美的反射）。这是一个重要的一点要记住的数字成像与CCD相机，光电二极管，光电倍增管，或视频传感器，探测器的灵敏度可以从很远的人眼的峰值波长。
除了 ​​光接口，通过灯的光传输外套堵塞的反射损失，可能会降低图像的亮度。随着灯泡的老化，玻璃或石英外套热潮或变暗，因为它失透或从灯丝或电极蒸发雾化金属涂层或渗透。值得一提的是，灯茄克的透射率可能会下降越快比可见光区域中的紫外线。在这种情况下的可见光的亮度，或用光度计测量的亮度，汞或氙弧灯的紫外线输出可能是一个好的指标。
毛玻璃漫射屏幕传输光其正常的百分之三以内行驶的只有10％到15％。甚至更少的光传输在斜入射的角度。因此，应避免磨玻璃扩散器，每当必须Zui大化的照明水平。
过滤器和双色镜传输落在通带变窄。许多干扰滤波器只有15％到30％的入射能量传输的波长处的峰值传输。然而，一些选择的多层干涉过滤器具有半传输带宽窄50埃可提供峰值的75％或更高的透射率。

偏光，微分干涉对比（DIC）光学偏光滤镜，也可以大大减少通过显微镜的光传输。偏振滤波器的透射率，用天然的光线透过率为20％，即使在偏振器和分析器轴设置在峰值传输到一个平行的位置，只有8％左右。与此相反，高品质的方解石棱镜具有防反射涂层盖板可以传输大约50％的每对入射的非偏振光的理论上的Zui大值。
图7中给出的是在现代的配置为透射和反射光照明和观察的光学显微镜的内部透镜元件的示意图。注意玻璃 - 空气界面之间的灯和场透镜和垂直照明器中的一个相似的编号在显微镜的基础上的广泛的数字。也有大量的接口窗口，棱镜，和观察管和目镜的透镜，以及在物镜转换器和冷凝器组件。
如上所讨论的，各种因素可以限制通过许多现代显微镜的光学元件的光透射。其中一个是追求Zui高分辨率，尤其是在对比增强模式下的图像本质上是暗淡的，以前上市的所有的因素应仔细检查。应该重申，通过整个显微镜的透射率是由所有的光学元件的透射率的商品。
照明亮度
在显微镜配有良好的校正后的照明器（包括聚光透镜系统）和聚光透镜，该字段的照度（照度）科勒照明的条件下，是由若干因素，包括固有亮度（平均发光密度）的光源和光源的聚光透镜的焦距。此外，数值孔径的聚光透镜系统，冷凝器孔径光阑开口尺寸的设置，和整体的透射率的照明系统帮助控制的照明度。
科勒照明下，从源上的每个点发出的光均匀地照射在显微镜视场光阑，以产生明亮而均匀地分布的照明领域（根据光源的性质）。因此，在视场光阑的开口的大小会影响照明系统领域的直径，而不是它的亮度。
选择光源的发光密度

表2
聚光透镜的焦距，投射图像的源，涵盖了整个冷凝器的可变光阑的开口不太短，收集电源，或f值（直径/焦距）的镜头不影响照度字段。在光源和聚光镜的数值孔径的平方确定该字段的照度的平均光密度，提供冷凝器光圈开度填充的图像的光源。收集功率的聚光透镜和光源的大小影响该字段仅当源图像的照度不覆盖整个冷凝器光圈。
综上所述，平均光密度（每单位面积的光输出的源程序）确定图像的亮度，而不是总的光输出，光通量，或光源的面积。从源头上的光通量是产品的发光密度和面积的源，后者只打了一个次要角色在确定平均光密度。因为源的发光密度限制该字段的照度，亮度的图像永远不会超过源的发光密度。换句话说，本场永远不能比源亮，无论什么巧妙的安排和反射镜，棱镜，透镜，或其他组件的组合受聘在眼镜直通车。表2列出了一些照明光源，具有相对高的发光密度在光学显微镜中是有用的，包括式样，如光通量，电弧尺寸，平均发光密度。
应该指出的是，许多浓缩弧灯（汞和氙气）提供一个非常高的程度的发光密度，并具有高度的非均匀度的光分布在电弧。好评，电弧亮在一个微小光点，其中一个电极相邻，即使在弧，其整体尺寸小（低至0.3×0.3毫米）。当这样的电弧的图像被投影到冷凝器光圈，不再有光照强度的均匀分布。因此，试样中的每个点所产生的衍射图案偏离了理想的艾里斑。然而，这些弧灯在显微镜（主要萤光），因为高的平均光密度对于某些应用是必不可少的。甲针对这种情况的补救办法是使用一个单一的光学纤维（纤维束）的光的扰码器，可以被添加到在显微镜没有明显损失的平均照度。图8示出在客观视野照明的情况下，没有均匀的照明强度的分布不均匀的后侧焦点面上的荧光图像。在图8（a）的试样图像均匀的照明，将投影到传感器上的可接受的图像。相反，在图8（b）中，试样没有适当地照亮整个视，并会导致在图像中，具有显着的强度的波动程度。

在显微镜聚光器在确定的质量和所提供的试样的照明度是一个关键因素。使用和不使用冷凝器顶部的透镜和物镜的前透镜之间的液浸介质，可以采用一些显微镜冷凝器。更多的时候，更高质量的冷凝器设计用于与一个特定的浸介质中，具有特定的折射率和色散。的培养基，它可以是油，甘油，水，或空气，填充冷凝器顶部的透镜元件和试样滑动的下表面之间的空间。
暗视野的大部分，一些相衬，微分干涉相差（DIC），偏振光光学要求冷凝器浸渍，以实现高的聚光镜的数值孔径。冷凝器的设计，以获得Zui佳的性能和Zui少的像差时，利用正确的液浸介质具有确定的折射率和色散。沉浸摒弃过去的临界角的光的损失，消除了额外的折射，Zui大限度地减少反射光的损失，并降低光接口，可以散射或反射的光线入射角高。这样的散射和反射，成为一个喇叭形的源，并且还可以改变光的偏振状态，从而减少了在高数值孔径的光学系统偏振消光。总之，浸入冷凝器领域的照度，以及图像质量的影响。达到Zui大的效能，冷凝器设计以浸入应浸泡与正确的介质。
虽然该字段的照度与聚光镜的数值孔径的平方上升，打开冷凝器可变光阑太多超出物镜的​​数值孔径匹配的产生光晕。此外，部分的照明射门物镜孔径产生的暗场图像的明视场图像上叠加，从而降低了图像的对比度。
结论
视频传感器或照相胶片平面上的曝光区域，在光学显微镜的放大倍数的平方成比例，如上面所讨论的。因此，图像亮度随放大倍率的平方。一般情况下，利用显微镜标本中公开的细节，但在同一时间，在显微镜是一种强效的聚光仪器。正如望远镜或双目提高了我们的视野，在夜间，在显微镜聚光功率可以有效地捕捉图像依稀照亮对象。
根据试样的特点，必须是可视化的，图像可能会变得更加有意义，如果收集更多的光线，而不是提高放大倍率。对于一些发光和荧光的标本，在光照强度可能是如此之低，高度放大的图像变为不可见的或检测不到的，因此完全没有意义的。在这种情况下，图像可以更容易理解，通过收集更多的光通过集成的光随着时间的推移（如果样品是静态的），或通过降低图像的放大率。
光极低水平的情况下，可以Zui大限度地利用图像的亮度Zui高的数值孔径目​​标提供Zui低的总体放大倍率。在某些情况下，它甚至是有益的，用眼减少，而不是增加，中间图像的放大率。
在努力传感器的分辨率相匹配的目标的分辨能力，有一个总的趋势，以提高放大的图像投影到CCD传感器或影像拾取装置。由于图像的亮度下降的放大倍数的平方和传感器功能只能在一个受限制的范围内的强度，增加的放大倍数可以导致的亮度电平低于灵敏度的传感器。如果试样是固定的或变化非常缓慢，可以显着提高的信号噪声比通过集成在几个帧的时间的图像，可以通过求和或平均的信号，或者更好的是，通过集成光电子在传感器本身。在这种情况下，时间分辨率提高空间信息的牺牲。不管如何，有往往拔河战争，和妥协之间，尝试提高分辨率和降低噪音水平，急剧上升的形象越来越远。当从图像的亮度是有限的，显微镜必须周密地调整仪器放大倍率，以取得Zui好的平衡。