全内反射荧光显微镜的优点及应用

TIRFM系统的优点及应用

TIRFM系统是全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope）的英文简称。这类显微镜是用隐失波作为样品的激发光源，并拥有高灵敏度和高时间分辨率的CCD相机（成像速率200Hz）捕捉样品荧光，它的优势在于比共聚焦显微镜的信噪比要高，相对于其他的光学显微镜，它的分辨率要更高一些，并且相对于电子显微镜来说，对生物样本损伤要更小，可以进行活体物质的研究和单分子的动态研究。
全内反射荧光显微镜凭借其独特的优势（它的荧光激发深度只在0～100nm的薄层范围内），从而被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移（FRET）、ATP酶的翻转，聚合物内单个分子的结构变化、以及等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动等方面，成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的Zui有前途的光学成像技术。
一、在生物单分子科学领域，单分子荧光探测主要有三个问题：
1）单分子发出的荧光信号通常很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器；
2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测，所以应该尽量降低背景激发光；
3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。

这些问题都可以利用TIRFM系统即全内反射荧光显微镜来解决！
二、观察蛋白分子的相互作用
1）通过荧光表识的分子共同定位，运用全内反射荧光显微镜对分子间相互作用可以直接观察，荧光共聚焦能量转移也能够检测到。
2）分子伴侣蛋白GroEL和伴侣辅助分子GroEState或者其底物乳球蛋白的相互作用已经在单分子水平进行了很好的研究。

三、应用于离子通道的研究
荧光标识的离子通道蛋白包埋到平面脂双层中，然后用物镜型全内反射荧光显微镜观察。利用全内反射荧光显微镜结合荧光共振能量转移或者双视角的光镜可以看到离子通道与其配基或者调节子之间的相互作用，同时可以在体内跟踪结像变化与离子电流。